平成２８年１０月２７日
科学技術振興機構（ＪＳＴ）
千葉大学
～がん転移や骨粗しょう症の原因解明に期待～
ポイント
- がん転移などに関与するＶ１回転分子モーターの詳細な分子メカニズムはこれまで解明されていなかった。
- 異なる２種類の構造を解明し、ＡＴＰのエネルギーが回転運動に変換される分子メカニズムモデルを提案した。
- Ｖ１回転分子モーターを阻害できれば、がん転移や骨粗しょう症の治療薬の開発につながるものと期待される。
ＪＳＴ 戦略的創造研究推進事業において、千葉大学 大学院理学研究科の村田 武士 教授と鈴木 花野 特任研究員らの研究グループは、たんぱく質ナノモーター注１）であるＶ型ＡＴＰａｓｅでＡＴＰのエネルギーが回転運動に変換されるメカニズムを原子レベルで明らかにしました。
Ｖ型ＡＴＰａｓｅは、細菌から人間まで多くの生体膜中に存在し、ＡＴＰのエネルギーを使って水素イオンを膜の外から中に運ぶことで膜内外の水素イオン濃度（ｐＨ）を調整しています。がん細胞や破骨細胞注２）の細胞膜にも存在し、がん細胞の増殖と転移や骨粗しょう症に関与する重要な創薬標的たんぱく質ですが、詳細な分子メカニズムは解明されていません。
ＡＴＰの加水分解と連動して、Ｖ型ＡＴＰａｓｅの中心軸が回転することで水素イオンを輸送します。本研究グループは、回転分子モーター部分のＸ線結晶構造解析注３）により、「ＡＴＰ結合待ち」および「ＡＤＰ解離待ち」という２種類の新しいスナップショット構造注４）を得ることに成功しました。
これにより、ＡＴＰのエネルギーが回転運動に変換されるメカニズムが原子レベルで明らかになり、さまざまなたんぱく質ナノモーターによる生体エネルギー変換メカニズムの理解が進展すると期待できます。 がん転移や骨粗しょう症の原因解明や、Ｖ型ＡＴＰａｓｅのモーターの回転を阻害する方法の予測が可能となり、たんぱく質の立体構造に基づいた治療薬の開発につながるものと期待されます。
本研究成果は、２０１６年１０月２７日（英国時間）に英国科学誌「Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ」のオンライン速報版で公開されます。
本成果は、以下の事業・研究領域・研究課題によって得られました。
戦略的創造研究推進事業 個人型研究（さきがけ）
| 研究領域 | ライフサイエンスの革新を目指した構造生命科学と先端的基盤技術 （研究総括：若槻 壮市 米国ＳＬＡＣ国立加速器研究所 光科学部門 教授、スタンフォード大学 医学部構造生物学 教授） |
|---|---|
| 研究課題 | 膜超分子モーターの相関構造解析による分子メカニズムの解明 |
| 研究者 | 村田 武士（千葉大学 大学院理学研究科 教授） |
| 研究実施場所 | 千葉大学 大学院理学研究科 理学４号棟 |
| 研究期間 | 平成２４年１０月～平成３０年３月 |
＜研究の背景と経緯＞
Ｖ型ＡＴＰａｓｅは、細菌から人間まで多くの生体膜中に存在し、ＡＴＰのエネルギーを使って水素イオンを膜の外から中に運ぶことで膜内外の水素イオン濃度（ｐＨ）を調整しています。がん細胞や破骨細胞の細胞膜にも存在し、がん細胞の増殖と転移や骨粗しょう症に関与していることが分かっています。そのため、Ｖ型ＡＴＰａｓｅの分子メカニズムを知ることは、これらの疾病原因の解明につながり、Ｖ型ＡＴＰａｓｅの阻害剤は治療薬として期待されています。Ｖ型ＡＴＰａｓｅは、水溶性たんぱく質のＶ１部分と膜たんぱく質のＶ０部分から構成されています（図１）。Ｖ１部分にはヌクレオチド注５）が結合できるサイトが３カ所あり、そこで順々にＡＴＰを加水分解することと連動して中心軸が回転し、これに伴いＶ０部分で水素イオンを輸送します。
最近、本研究グループは、ヒトＶ型ＡＴＰａｓｅによく似た腸球菌Ｖ型ＡＴＰａｓｅのＶ１部分（Ａ３Ｂ３ＤＦ複合体）の詳細構造をＸ線結晶構造解析によって明らかにしました（Ａｒａｉ Ｓ． ｅｔ ａｌ． ２０１３， Ｎａｔｕｒｅ， ４９３， ７０３－７０７．）。得られたＶ１－ＡＴＰａｓｅの３カ所のヌクレオチドが結合するサイトは、ＡＴＰが結合できない「ＡＴＰ非結合型」、ＡＴＰが結合している「ＡＴＰ結合型」、ＡＴＰが加水分解を待っている「ＡＴＰ分解型」の異なる構造状態で形成されていました。
「ＡＴＰ分解型」の状態が存在することから、このＶ１－ＡＴＰａｓｅの構造は「ＡＴＰ加水分解待ち」のスナップショット構造であると結論しました。Ｖ１－ＡＴＰａｓｅの回転メカニズムを理解するためには、ＡＴＰ加水分解後の構造変化を知ることが必須となります。そこで本研究では、ＡＴＰの加水分解後の異なるスナップショット構造を得ることを目的に、ＡＴＰ加水分解で生じるＡＤＰやリン酸が結合したＶ１－ＡＴＰａｓｅのＸ線結晶構造解析を行いました。
＜研究の内容＞
ヌクレオチドが結合していないＶ１－ＡＴＰａｓｅの結晶を低濃度、または高濃度のＡＤＰ溶液に漬け込むことで、異なる２種類のＶ１－ＡＴＰａｓｅのＸ線結晶構造を得ることができました（図２）。
低濃度のＡＤＰ存在下で得られた構造（図２ａ、ｂ）と既知の構造（図２ｅ）を比較したところ、ＡＴＰの加水分解待ちの「ＡＴＰ分解型」にＡＤＰが結合することで、新しいフォーム「ＡＤＰ結合型」への構造変化が引き起こされ、その影響で、中心軸ＤＦ複合体を含め、全体的に構造が変化していました。ＡＴＰが結合できない「ＡＴＰ非結合型」は、ＡＴＰが結合できる新しいフォーム「ＡＴＰ待機型」に構造変化していました。このことから、低濃度のＡＤＰ存在下で得られたＶ１－ＡＴＰａｓｅは「ＡＴＰ結合待ち」のスナップショット構造であると結論しました。
高濃度のＡＤＰ存在下で得られた構造（図２ｃ、ｄ）には、３つのヌクレオチド結合サイトすべてにＡＤＰが結合していました。特筆すべきは、前述の「ＡＴＰ待機型」のヌクレオチドが結合できる部位に、ＡＤＰと、リン酸の類似体であるＳＯ４２－が結合していたことです。これにより「ＡＴＰ待機型」は閉じていき、新しいフォーム「ＡＴＰ半結合型」への構造変化が引き起こされ、中心軸を含む全体構造が変化していました。従って、高濃度のＡＤＰ存在下で得られたＶ１－ＡＴＰａｓｅは「ＡＤＰ解離待ち」のスナップショット構造であると結論しました。
また、ＡＴＰの類似体で加水分解しないＡＭＰ－ＰＮＰ注６）や、リン酸が結合したＶ１－ＡＴＰａｓｅの結晶構造も明らかにしました（図３）。これらの構造は２０１３年に得られたＶ１－ＡＴＰａｓｅの構造と同じであり、ＡＭＰ－ＰＮＰやリン酸の結合では構造変化が引き起こされないことが明らかになりました。
以上の成果を統合すると、Ｖ型ＡＴＰａｓｅでＡＴＰのエネルギーが回転運動に変換されるには、まず「ＡＴＰ加水分解待ち」構造（図４左上）の「ＡＴＰ分解型」に結合しているＡＴＰがＡＤＰとリン酸に加水分解した後、リン酸が解離してＡＤＰのみが結合した状態になることでＶ１－ＡＴＰａｓｅの構造変化が起こり、「ＡＴＰ結合待ち」構造（図４右上）になると考えられます。生じた「ＡＴＰ待機型」にＡＴＰが結合することにより、さらに構造変化が起こり、「ＡＤＰ解離待ち」構造（図４右下）になります。最終的にＡＤＰが解離することで、回転軸が１２０度回転し、最初の「ＡＴＰ加水分解待ち」構造（図４左下＝左上）に戻るという分子メカニズムモデルを提案することができました。
＜今後の展開＞
本研究でＶ１－ＡＴＰａｓｅの２種類の新しいスナップショット構造が解明されたことにより、ＡＴＰが加水分解された後の構造変化やヌクレオチドとの親和性の変化など、多くの情報を理解することができました。これにより、Ｖ型ＡＴＰａｓｅだけでなく、さまざまなたんぱく質ナノモーターを含む生体エネルギー変換メカニズムの一般原理の理解が進展するものと期待できます。また、Ｖ１－ＡＴＰａｓｅの回転の詳細な分子メカニズムの解明により、Ｖ１－ＡＴＰａｓｅと関連するがん転移や骨粗しょう症などの疾病原因の理解と、回転の阻害による治療薬の開発につながることが期待されます。
＜参考図＞
図１ Ｖ型ＡＴＰａｓｅの構造モデル
Ｖ型ＡＴＰａｓｅは９～１３種類のたんぱく質からなる超分子複合体で、水溶性たんぱく質部分（Ｖ１部分）と膜たんぱく質部分（Ｖ０部分）からなる。触媒頭部（Ａ３Ｂ３；青色と紫色の６量体）でＡＴＰを加水分解し、赤い点線で囲まれた回転軸（ＤＦｄ）とローターリング（ｃ）を回転させ、水素イオンを細胞外（またはオルガネラ内）へ輸送する。
図２ ＡＤＰが結合したＶ１－ＡＴＰａｓｅ（Ａ３Ｂ３ＤＦ複合体）のＸ線結晶構造
- ａ） 横から見た低濃度ＡＤＰ存在下のＶ１－ＡＴＰａｓｅの結晶構造。
- ｂ） 上から見た低濃度ＡＤＰ存在下のＶ１－ＡＴＰａｓｅの結晶構造。見やすくするためにＡ３Ｂ３複合体のＣ末端ドメイン、Ｄサブユニットのみを表示している。３カ所あるヌクレオチド結合サイトを赤い矢印で示した。
- ｃ）、ｄ） 高濃度ＡＤＰ存在下のＶ１－ＡＴＰａｓｅの結晶構造。表示方法はａ）、ｂ）と同様。
- ｅ） 上から見たヌクレオチドが結合していないＶ１－ＡＴＰａｓｅの結晶構造。表示方法はｂ）と同様。
図３ ＡＭＰ－ＰＮＰまたはリン酸が結合したＶ１－ＡＴＰａｓｅのＸ線結晶構造
- ａ） 横から見た高濃度ＡＭＰ－ＰＮＰ存在下のＶ１－ＡＴＰａｓｅの結晶構造。
- ｂ） 上から見た高濃度ＡＭＰ－ＰＮＰ存在下のＶ１－ＡＴＰａｓｅの結晶構造。見やすくするためにＡ３Ｂ３複合体のＣ末端ドメイン、Ｄサブユニットのみを表示している。３カ所あるヌクレオチド結合サイトを赤い矢印で示した。
- ｃ）、ｄ） リン酸存在下のＶ１－ＡＴＰａｓｅの結晶構造。表示方法はａ）、ｂ）と同様。
図４ Ｖ１－ＡＴＰａｓｅの分子メカニズムモデル
上から見たＶ１－ＡＴＰａｓｅのスナップショット構造（左上と左下：「ＡＴＰ加水分解待ち」構造、右上：「ＡＴＰ結合待ち」構造、右下：「ＡＤＰ解離待ち」構造）。見やすくするためにＡ３Ｂ３複合体のＣ末端ドメイン、Ｄサブユニットのみを表示している。３カ所あるヌクレオチド結合サイトを赤い矢印で示した。Ｖ型ＡＴＰａｓｅでＡＴＰのエネルギーが回転運動に変換されるには、まず「ＡＴＰ加水分解待ち」構造（左上）の「ＡＴＰ分解型」に結合しているＡＴＰがＡＤＰとリン酸に加水分解した後、リン酸が解離してＡＤＰのみが結合した状態になることでＶ１－ＡＴＰａｓｅの構造変化が起こり、「ＡＴＰ結合待ち」構造（右上）になると考えられる。生じた「ＡＴＰ待機型」にＡＴＰが結合することにより、さらに構造変化が起こり、「ＡＤＰ解離待ち」構造（右下）になる。最終的にＡＤＰが解離することで、回転軸が１２０度回転し、最初の「ＡＴＰ加水分解待ち」構造（左下＝左上）に戻るという分子メカニズムモデルを提案した。
＜用語解説＞
- 注１） たんぱく質ナノモーター
- 生物の細胞内でＡＴＰの加水分解によって得られたエネルギーを、機械的な運動に変換するナノメートル（１０－９メートル）程度のたんぱく質複合体の総称。
- 注２） 破骨細胞
- 骨構築する過程において、骨を破壊（骨吸収）する役割を担っている細胞のこと。
- 注３） Ｘ線結晶構造解析
- 解析対象のたんぱく質を結晶化し、Ｘ線照射によって得られる回折データから、たんぱく質の原子レベルでの立体構造を決定する手法。
- 注４） スナップショット構造
- たんぱく質が機能するときの動的な構造変化の中の１つの静止構造のこと。
- 注５） ヌクレオチド
- 塩基、糖、リン酸から構成される物質で核酸の構成単位。ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ－ＰＮＰなどを含む。
- 注６） ＡＭＰ－ＰＮＰ
- ＡＴＰの非分解性の類似体。β—とγ—リン酸間が窒素原子に置き換わっているため、加水分解反応が阻害される。
＜論文情報＞
“Crystal structures of the ATP-binding and ADP-release dwells of the V1 rotary motor”
（Ｖ１回転モーターの「ＡＴＰ結合待ち」および「ＡＤＰ解離待ち」のスナップショット構造）
doi ：10.1038/ncomms13235
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